近年來，由于細胞治療方法的興起，人們?nèi)找嫘枨竽軌蚋哔|(zhì)量、穩(wěn)健、有效進行細胞表征測定的方法。細胞計數(shù)，作為細胞療法中基礎(chǔ)的檢測項目，現(xiàn)今需要更高的檢測可信度。那么，細胞計數(shù)方法在上有標準嗎？2017年4月，美國國家標準與技術(shù)研究院（NIST）&食品與藥物管理局（FDA）共同舉辦了一場專注于細胞計數(shù)的研討會，聚焦于選擇、設(shè)計和驗證細胞計數(shù)方法，以及如何得到充分的計量保證。近50位來自于工業(yè)界、學術(shù)界和政府監(jiān)管機構(gòu)的專家參與了研討會。Nexcelom Bioscience作為為數(shù)不多的受邀細胞計數(shù)設(shè)備制造商之一列席參加了本次會議，與業(yè)界專家們共同討論細胞治療中關(guān)于細胞計數(shù)的各種問題。本文總結(jié)了此次會議的討論重點。（文末點擊“閱讀原文”下載英文全文）

研討會的總體主題：我們需要根據(jù)細胞樣品的屬性，細胞計數(shù)的目的和要求，來選擇適合目的（fit-for purpose）的測量方法。例如，藥物篩選和細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)與放行過程中的細胞計數(shù)要求會有顯著不同。Fit-for purpose是指選擇的方法是否適合細胞計數(shù)的預(yù)期目的。理想的適用性需要滿足兩方面的要求，一是能解決生物學問題，二是獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量（靈敏度、精密度、準確度）足夠好，足以支持下游決策。一個更標準化的設(shè)計、限定和驗證符合fit-for purpose原則的細胞計數(shù)方法的流程，將加速產(chǎn)品的開發(fā)和轉(zhuǎn)化。

研討會上討論的主要內(nèi)容：

細胞計數(shù)測量過程

細胞計數(shù)遵循相同的常規(guī)步驟：（i）樣品準備，（ii）手工計數(shù)或使用儀器設(shè)備的自動計數(shù)，（iii）數(shù)據(jù)分析（如圖1）。

測量過程中的很多方面都可能給結(jié)果帶來顯著的可變性。此外作為測量過程中“輸入”的細胞樣品，屬性可能會有大范圍的波動，也會給計數(shù)結(jié)果帶來顯著的可變性。細胞樣品本身就很復(fù)雜，具有一系列穩(wěn)定或者變化的性質(zhì) - 樣品配方（如培養(yǎng)基組分）、成分（如不同細胞類型和功能）和固有的生物學可變性（如供體變化和細胞狀態(tài)）。認識到細胞計數(shù)過程和細胞樣品相關(guān)的各種影響因素，研討會上專家們討論了提高細胞計數(shù)可信度的策略。

從監(jiān)管角角度看細胞計數(shù)

FDA的與會人員強調(diào)了細胞計數(shù)對于檢測細胞治療產(chǎn)品質(zhì)量（如屬性、純度、效價和劑量）的重要性。他們重申基于不同目的，細胞計數(shù)方法可能不同，這主要取決于細胞治療產(chǎn)品本身。他們進一步指出，雖然在獲得許可證之前，細胞計數(shù)等試驗方法不需要進行驗證；但越早建立高可信度的方法，越有利于產(chǎn)品轉(zhuǎn)化（圖2）。FDA與會人員特別指出：確定適當?shù)募毎嫈?shù)方法，了解可用的儀器，有助于共識性文件標準的制定和參考樣品的開發(fā)，有利于解決再生醫(yī)學療法中細胞計數(shù)方面的挑戰(zhàn)。

建立細胞計數(shù)方面的質(zhì)量屬性

細胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量屬性可通過測定相關(guān)的、可測量的生物學指標來評估。許多質(zhì)量屬性直接（如總細胞濃度、活細胞濃度）或間接（如使用細胞濃度歸一化處理的活力數(shù)據(jù)）使用細胞計數(shù)結(jié)果獲得數(shù)據(jù)。選擇細胞計數(shù)方法時，要明確理解測量對象和預(yù)期質(zhì)量屬性之間的關(guān)系（如活細胞濃度、存活率百分比）。

例如活細胞濃度是一種差異細胞計數(shù)，需要將活細胞與死細胞區(qū)分開，與細胞類型無關(guān)?；罴毎麧舛扔挚梢赃M一步分解成兩個屬性組成：活細胞數(shù)和樣品體積。

測定活細胞數(shù)時，很多生物學指標可以用來區(qū)分活細胞和死細胞。這些生物學指標包括細胞膜完整性、代謝活力和細胞復(fù)制能力。生物學指標可以通過不同測試方法測定，且每種測試方法都有不同的測量對象。例如臺盼藍排除和PI核酸染色法都可以通過測試細胞膜完整性來區(qū)分活細胞和死細胞。對同一個生物學指標的類似檢測，不同染料（大小、親和力不同）對細胞膜滲透性的固有不同和顯示信號（比色或者熒光）的不同，也會導致結(jié)果上的差異。

另一個屬性組成是樣品的體積。體積可以通過校準過的儀器來獲得（例如已測定的計數(shù)室尺寸）：間接方法如同時用基于流式原理的方法測定已知濃度的微珠；或者通過流量計等方法直接測定。體積測定偏差將導致結(jié)果偏差，降低活細胞濃度測定結(jié)果精密度。另外在測試活細胞濃度時，儀器與儀器之間結(jié)果的差異，有些情況下可能是因為儀器體積校準之間的差異造成的。

總的來說，應(yīng)選擇反映預(yù)期測量目的的生物學指標；當應(yīng)用這些生物學指標時，能夠反映細胞治療產(chǎn)品的作用機理。此外，測量目標應(yīng)盡可能與生物學指標直接相關(guān)。專家強調(diào)需要了解細胞計數(shù)的生物學基礎(chǔ)，特別是當某個細胞亞群被認為與生物學或臨床結(jié)果相關(guān)時的差異細胞計數(shù)。

選擇與設(shè)計細胞計數(shù)方法

自18世紀以來，使用血球計數(shù)板進行手工計數(shù)一直被認為是細胞計數(shù)的金標準。研討會的參會人員表示這種觀點現(xiàn)在依然存在。手工計數(shù)非常費時，并且誤差很大，會給產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)帶來很多問題。隨著技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在許多基于自動成像和流式原理的方法被用來進行總細胞和亞細胞群計數(shù)?？蛇x的方法很多，樣品類型以及細胞計數(shù)目的也各不相同。

細胞計數(shù)檢測過程的考慮因素大致上可以分為：（i）生物學相關(guān)因素；（ii）測量特性相關(guān)因素，包括計量保證策略；（iii）合規(guī)性及其他實際因素。生物學相關(guān)因素是指計數(shù)方法基于生物學指標獲得細胞數(shù)量的能力。分析方法的測量特性相關(guān)因素包括計數(shù)方法提供足夠特異、精密和穩(wěn)健數(shù)據(jù)的能力；控制測量過程中的可變性并確保從中的可信度的能力也是需要的；另一個需要重點考慮的因素是方法在產(chǎn)品研發(fā)管線各個環(huán)節(jié)中的轉(zhuǎn)化能力。理想情況下，研發(fā)過程中使用的細胞計數(shù)方法應(yīng)該能夠應(yīng)用到生產(chǎn)甚至放行中。細胞計數(shù)系統(tǒng)需要盡量少的可變因素和校準要求，內(nèi)置自控系統(tǒng)。緊接下來需要考慮的就是合規(guī)性，包括是否滿足GMP （Good Manufacturing Practice）要求。如果不止使用一種計數(shù)方法，或者在不同地點使用同一種方法，需要考慮方法之間的可比性。其他需要考慮的實際因素包括：用量、價格、所需時間以及培訓。一個特別需要指出的挑戰(zhàn)是計數(shù)方法能夠允許使用者自行修改調(diào)整的程度。儀器提供越多的微調(diào)設(shè)置，將提供更大的靈活性和可優(yōu)化性；另一方面，增加儀器的靈活性意味著需要更多的培訓，以及在生產(chǎn)中做更多記錄。

實驗設(shè)計（DOE）在優(yōu)化細胞計數(shù)流程中的應(yīng)用

一旦細胞計數(shù)的目的和大致方法已經(jīng)確定，建議使用“實驗設(shè)計（Design of Experiments ，DOE）來進行方法優(yōu)化和穩(wěn)健性測試。

專家指出很多因素影響了細胞計數(shù)實驗。這些因素包括準備細胞樣品時使用的稀釋液。稀釋液可能影響樣品的穩(wěn)定性，引入或者減少影響計數(shù)的碎片或雜質(zhì)。儀器與儀器之間的差異也是一個挑戰(zhàn)，需要使用更穩(wěn)健的體積校準策略來改進，例如使用已知濃度的微珠或其他體積校準方法。很多因素會影響細胞計數(shù)方法，精心設(shè)計的DOE有助于理解每個因素的作用以及各個因素在細胞計數(shù)過程中的聯(lián)系。

細胞計數(shù)驗證

基于現(xiàn)有的經(jīng)驗，很多參會者推薦了人類用藥物技術(shù)要求協(xié)調(diào)理事會（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的指南：“Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) for Validation of Analytical Methods”【1】用于細胞計數(shù)方法驗證。ICH傳統(tǒng)上專注于藥物制造，而不是細胞治療產(chǎn)品。指南中描述了準確度、精密度、特異性、檢測限、定量限、線性、范圍和穩(wěn)健性的概念。這個通用的驗證框架在很大程度上適用于細胞的分析測量，但對于細胞治療產(chǎn)品要做出一些針對性的調(diào)整。

受限于動態(tài)、復(fù)雜，有時數(shù)量還有限的樣品，需要對驗證步驟進行改變，或者增加額外的考量。例如在考察細胞計數(shù)中間精密度（不同操作者、不同儀器、不同日期、不同批次之間的差異）時，實驗設(shè)計時需要考慮整個周期中樣品的穩(wěn)定性，尤其需要考慮可能影響細胞計數(shù)的樣品性質(zhì)（如細胞活率、細胞聚集、碎片和氣泡形成等）。

準確度對細胞計數(shù)來說，是個*的挑戰(zhàn)。理想的細胞計數(shù)計數(shù)結(jié)果應(yīng)該既精密又準確。細胞計數(shù)的精密度可以通過實驗確定。但因為缺少合適的參考樣品和對照方法，細胞計數(shù)的準確度很難獲得。

評估準確度一般是通過對比測定結(jié)果與具有參考值和已知不確定性的恰當參考樣品的檢測結(jié)果，或者通過與對照方法進行比較。因為細胞計數(shù)測定缺少通用的參考樣品，基于人工顯微鏡觀察計數(shù)的“金標準”也具有很大的偏差和不精密性，通過上述方法檢測準確度不能滿足細胞治療產(chǎn)品對準確度的要求。

為了滿足工業(yè)界的需要，NIST近期開發(fā)出了在沒有合適對照方法和樣品的情況下，評估細胞計數(shù)方法的策略。這些方法通過系列稀釋試驗設(shè)計，評估了細胞計數(shù)方法的精密度和比例性。在這樣的實驗設(shè)計中，細胞計數(shù)結(jié)果對梯度稀釋的比例響應(yīng)作為評價計數(shù)質(zhì)量的內(nèi)部基準【2】。這個過程不受測定方法和細胞類型的影響，提供了一種不依賴于“金標準”方法或參考樣品比較，就可以評估細胞計數(shù)方法質(zhì)量的途徑。這個策略的目標就是解決細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)者在細胞計數(shù)方法轉(zhuǎn)型或者選擇“fit for purpose”計數(shù)方法時遇到的挑戰(zhàn)。

細胞計數(shù)的生物或非生物參考樣品及內(nèi)參

合適的參考樣品將有助于對細胞計數(shù)準確度的評估，有利于對細胞計數(shù)方法之間進行比較。因此，研討會討論中很重要的一部分就集中在現(xiàn)今細胞計數(shù)參考樣品的使用和參考樣品的需求上。會上達成了一個重要共識：使用者需要理解各種參考樣品在計數(shù)過程中的作用。細胞治療從業(yè)者需要優(yōu)化的或者新的參考樣品來評估細胞計數(shù)的準確度。會上討論了生物的（基于細胞）和非生物的（主要是微珠）參考樣品的作用。有人指出針對測定過程的特定方面需要選擇合適的參考樣品，且不應(yīng)在其預(yù)期使用目的之外進行過度解讀。

細胞計數(shù)計量保證策略

為了保證測量結(jié)果的質(zhì)量，需要使用基于計量科學原則的計量保證策略。理想的測量結(jié)果由以下3點構(gòu)成：（i）以常用單位表示的數(shù)值，（ii）測量不確定度，（iii）可以保證測量結(jié)果質(zhì)量的證據(jù)。對細胞計數(shù)來說，了解測量過程是否會以及何時會達不到標準很重要。在這種情況下，需要設(shè)計計量保證策略以提供足夠的證據(jù)來監(jiān)測測量過程的質(zhì)量，提供計數(shù)結(jié)果是否可靠的指示。測量保證的證據(jù)通常以測量過程中的中間測量形式出現(xiàn)，在整個測量過程中的特定點建立可信度。測量保證策略可以每年或每季度不定期實施，通過驗證和SOP作為質(zhì)量保證計劃的一部分。儀器驗證步驟等其他策略可以為每天的測量提供保證；或者與每次測量同時進行，以提供每個測量值的可信度。



當計量保證策略應(yīng)用到每次測量中時，它們作為測量步驟中的控制環(huán)節(jié)，為測量過程提供同時驗證。這種策略在長期記錄和監(jiān)測一種分析方法時非常有效，并能夠識別方法中的偏移和錯誤。很多測量步驟中的控制環(huán)節(jié)可以直接使用細胞計數(shù)的數(shù)據(jù)，或者通過使用測試樣品即可進行的簡單實驗來完成。這樣的設(shè)計策略具有實際可操作性。例如，細胞計數(shù)結(jié)果是單位體積的細胞數(shù)；在使用細胞計數(shù)值做出決策之前我們有幾個假設(shè)。這些假設(shè)包括：（i）細胞是懸浮于介質(zhì)中的單個物體，（ii）所有目標細胞都被計數(shù)了，而其他的都被排除了，（iii）已知體積已經(jīng)被驗證過，（iv）試劑和儀器工作正常，（v）檢測結(jié)果在線性范圍內(nèi)，在檢出限以上，在飽和限以下。在測量時需要收集證明以上假設(shè)是可信的證據(jù)。例如，需要設(shè)置對照試驗和數(shù)據(jù)分析策略，在試劑出現(xiàn)問題、細胞過度聚集、流路堵塞、儀器狀態(tài)改變或預(yù)設(shè)體積錯誤時提醒使用者。當設(shè)置了合適的測量步驟中的控制環(huán)節(jié)，細胞計數(shù)測定過程的質(zhì)量才能獲得保證（圖4）。

總結(jié)

本次細胞計數(shù)研討會的一個關(guān)鍵結(jié)論就是：獲得高質(zhì)量細胞計數(shù)結(jié)果的方法并不是單一的。使用者必須要考慮細胞計數(shù)的目的，設(shè)計合適的方法和計量保證策略。人們需要開發(fā)、鑒定和驗證細胞計數(shù)方法的通用策略和原則，這些前期的努力會決定后期標準化的考慮和努力方向。關(guān)于細胞計數(shù)的建議包括：（i）文件標準實踐指南，（ii）一致的術(shù)語，以實現(xiàn)共同理解和清晰的溝通，（iii）生物以及非生物參考樣品以提升計量保證，（iv）有別于“one-size fits all”觀念的，基于“fit-for-purpose”原則的個體化檢測策略。

Nexcelom Bioscience 作為受邀細胞計數(shù)設(shè)備供應(yīng)商之一參與了本次研討會，與多位同行、細胞治療從業(yè)者及政策法規(guī)制定者進行了廣泛的交流和討論，也更加深入地了解了行業(yè)所面臨的挑戰(zhàn)以及業(yè)界對相關(guān)設(shè)備制造商的期望。作為細胞計數(shù)領(lǐng)域的，Nexcelom責無旁貸，會一如既往地以技術(shù)創(chuàng)新為驅(qū)動力，打造基于用戶需求的產(chǎn)品，為細胞治療產(chǎn)業(yè)和人類健康事業(yè)的發(fā)展貢獻應(yīng)有的力量！

參考文獻

[1] ICH. Validation of analytical procedures: text and methodology. In: Secretariat I, editor. ICH HarmonisedTripartite Guideline. Geneva, Switzerland: ICH; 2005.
[2] Sarkar S, Lund SP, Vyzasatya R, Vanguri P, Elliott JT, Plant AL, et al. Evaluating the quality of a cell counting measurement process via a dilution series experimental design. Cytotherapy 2017;19:1509–21.