697急性淋巴細胞B細胞白血病細胞
細胞的凍存與復蘇
為了防止因污染或技術(shù)原因使長期培養(yǎng)功虧一簣,考慮到培養(yǎng)細胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異,有時因寄贈、交換和購買,培養(yǎng)細胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室,策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細胞株的遺傳特性極為重要?,F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(-70℃~-196℃)的特點。細胞深低溫保存的基本原理是:在-70℃以下時,細胞內(nèi)的酶活性均己停止,即代謝處于*停止狀態(tài),故可以長期保存。細胞低溫保存的關(guān)鍵,在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi),水晶呈針狀,極易招致細胞的嚴重損傷。
一、細胞的凍存:為避免污染造成的損失,最小化連續(xù)細胞系的遺傳改變和避免有限細胞系的老化和轉(zhuǎn)化,需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前,細胞應該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基,成分可能如下:
包含10%甘油的*培養(yǎng)基,
包含10%二甲基亞砜(DMSO)的*培養(yǎng)基,
50% 細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基,或
50% 細胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對于無血清培養(yǎng)基,一些普通的培養(yǎng)基成分可能是:
50% 細胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基,或
包含有7.5%二甲基亞砜和10%細胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
697急性淋巴細胞B細胞白血病細胞
1、懸浮細胞
計數(shù)將要凍存的活細胞。細胞應該處于對數(shù)生長期。以大約200~400g離心5分鐘沉淀細胞,使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
以1×107到5×107細胞/ml密度,在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細胞,或者以0.5×107到1×1027在無血清培養(yǎng)基中,再次懸浮細胞。
分裝進凍存管,將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2、貼壁細胞
使用分離試劑從基層分離細胞,分離時盡可能溫和,使對細胞的損傷減少到最小。
在*生長培養(yǎng)基中,再次懸浮分離細胞,確定有活力細胞數(shù)。
以大約200g離心5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積,不要攪亂細胞。
以5×106到1×106細胞/ml密度,在凍存液中懸浮細胞。
分裝進凍存管,將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中,5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
細胞以1℃/分鐘進行冷凍,可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中,然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱,要輕柔操作。凍存細胞要快速融化,并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細胞對凍存劑(DMSO或甘油)敏感,離心去除凍存培養(yǎng)基,然后加入*生長培養(yǎng)基中。
1、直接鋪板方法
取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細胞。1ml凍存細胞使用10~20ml*生長培養(yǎng)基。進行活細胞計數(shù),細胞接種應該至少在3×105活細胞/ml。培養(yǎng)細胞12到24小時,更換新鮮的*生長培養(yǎng)基,去除凍存劑。
2、離心方法
取出貯存細胞,37℃水浴中快速融化。
把1到2ml凍存細胞加入到大約25ml*生長培養(yǎng)基,輕輕混勻。
以大約80x g離心2到3分鐘。
棄去上清。
在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細胞,并且進行活細胞計數(shù)。
細胞鋪板,細胞接種應該至少為3×105活細胞/ml。
三、細胞的分化、衰老與死亡
1、細胞的分化:一個成年人全身細胞總數(shù)約1012個,可以區(qū)分為200多種不同類型的細胞:形態(tài)結(jié)構(gòu),代謝,行為,功能等各不相同。追根溯源,這么多種細胞均來自一個受精卵細胞。所以,通常把發(fā)育過程中,細胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發(fā)生在胚胎階段,也發(fā)生在胎兒出生以后,乃至成人階段。例如,人體血細胞的產(chǎn)生和分化,這個過程在人的一生中一直持續(xù)著。
由旺盛生長不斷分裂的細胞,轉(zhuǎn)入分化,通常從細胞周期中G1期開始時一個確定的點G0點“逃逸”出細胞周期。旺盛生長分裂的細胞和各種分化了的細胞,它們的基因表達和代謝活動各不相同。
2、細胞的衰老:體外細胞培養(yǎng)實驗證明:
成纖維細胞:來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。
細胞衰老過程中會發(fā)生一系列的變化,包括:蛋白質(zhì)合成速度降低,已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn);同時,細胞核,線粒體,膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變。
細胞衰老原因,尚無定論,出現(xiàn)過好幾種理論與假說,其中得到較廣泛認可的是“自由基損傷假說”。
3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正?,F(xiàn)象,常見的細胞死亡形式有3種:壞死、凋亡和細胞毒性。多細胞生物的生命活動中,因為環(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵,導致一部分細胞死亡,稱為細胞的病理死亡,或細胞壞死。壞死是細胞暴露于嚴重的物理或化學刺激時導致的細胞死亡;細胞毒性是由細胞或者化學物質(zhì)引起的單純的細胞殺傷事件,不依賴于其它兩種細胞死亡機理,如殺傷T細胞的細胞毒性作用。